食品中二氧化硫的测定方法验证
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冼土秀，欧志秀，周丽贤，赵俊峰，许广元
（广东省绿色认证检测中心有限公司，广东广州510440）
二氧化硫被广泛用于食品加工中，是国内外食品加工业中允许使用的食品添加剂，具有漂白、护色、防腐和抗氧化的作用[1]。食品中的二氧化硫来源有外源性和内源性，外源性主要由采用硫磺熏制食品或使用能产生二氧化硫的盐类作食品添加剂时产生，内源性由某些食品在发酵过程中产生。按照国家标准合理使用二氧化硫不会对人体健康造成危害，但长期过量摄入二氧化硫可能导致人体呼吸系统疾病和多组织受损[2]。因此，我国规定了食品添加剂二氧化硫的使用限量和检测方法[3]。
《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2016）即将于2022年12月30日被废止，届时将被《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）所替代，主要变化在于修改了原滴定法为酸碱滴定法，增加了分光光度法和离子色谱法。检验方法的变更需要进行方法验证，本文对第二法分光光度法进行验证，验证了该方法的线性、线性范围、检出限、定量限、精密度及准确度6个参数。
1.1原理
样品直接用甲醛缓冲吸收液浸泡或加酸充氮蒸馏，使其中的二氧化硫释放被甲醛溶液吸收，生成稳定的羟甲基磺酸加成化合物，酸性条件下与盐酸副玫瑰苯胺生成蓝紫色络合物，该络合物的吸光值与二氧化硫的浓度成正比[4]。
1.2适用范围
《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）第二法分光光度法中，直接提取法适用于白糖及白糖制品、淀粉及淀粉制品、生湿面制品等无油脂且无颜色干扰试样中总二氧化硫的测定；
充氮蒸馏提取法适用于葡萄酒、赤砂糖等有颜色试样中总二氧化硫的测定。
1.3试剂与材料
1.3.1试剂与标准品
氨基磺酸铵（H6N2O3S）；
乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8）；
甲醛（CH2O）；
邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4）；
0.2%盐酸副玫瑰苯胺（C20H20ClN3）溶液；
冰乙酸（C2H4O2）；
磷酸（H3PO4）；
二氧化硫标准溶液（100μg·mL-1），具有国家认证并授予标准物质证书。
1.3.2仪器和设备
UV-2600紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；
电子天平，感量为0.01g；
玻璃充氮蒸馏器。
1.3.3试剂配制
氢氧化钠溶液（1.5mol·L-1）：称取6.0gNaOH，溶于水并稀释至100mL。
乙二胺四乙酸二钠溶液（0.05mol·L-1）：称取1.86g乙二胺四乙酸二钠（简称EDTA-2Na），溶于水并稀释至100mL。
甲醛缓冲吸收储备液：称取2.04g邻苯二甲酸氢钾，溶于少量水中，加入36%～38%的甲醛溶液5.5mL，0.05mol·L-1EDTA-2Na溶液20.0mL，混匀，加水稀释并定容至100mL，贮于冰箱中冷藏保存。
甲醛缓冲吸收液：量取甲醛缓冲吸收储备液适量，用水稀释100倍，临用时现配。
盐酸副玫瑰苯胺溶液（0.5g·L-1）：量取0.2%盐酸副玫瑰苯胺溶液25.0mL，分别加入磷酸30mL和盐酸12mL，用水稀释至100mL，摇匀，放置24h，备用（避光密封保存）。
氨基磺酸铵溶液（3g·L-1）：称取0.30g氨基磺酸铵（H6N2O3S）溶于水并稀释至100mL。
盐酸溶液（6mol·L-1）：量取盐酸50mL，缓缓倾入50mL水中边加边搅拌。
1.4方法
参照（GB5009.34—2022）《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》第二法分光光度法进行测定。
2.1线性和线性范围
二氧化硫标准使用液浓度为10μg·mL-1。吸取0mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL和3.00mL的二氧化硫标准使用液用甲醛缓冲吸收液定容至10.00mL。经过计算，该系列标准溶液中二氧化硫的质量分别为0μg、2.0μg、5.0μg、10.0μg、20.0μg和30.0μg。标准曲线的制作按照标准进行，以质量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。标准工作曲线为y=0.0266x+0.0395，R2=0.9998。
根据《合格评定化学方法确认和验证指南》（GB/T27417—2017）规定准确定量的方法，线性回归方程的相关系数不低于0.99，本实验按照《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）规定的测试条件进行测试，其线性回归方程为y=0.0266x+0.0395，相关系数为0.9998，线性范围为0～30.0μg，符合标准规定的要求。
2.2检出限和定量限
检出限采用空白标准偏差法评估，即通过分析大量（n≥10）样品空白确定检出限（LOD）。本次实验通过10次样品空白独立测试，计算出检测结果的算数平均值（X）和标准偏差（S）确定检出限（LOD），计算公式为LOD=X+3S；
为增加数据的可信性，本实验以10倍检出限作为定量限[5]。具体结果见表1和表2。
表1固体或半流体样品的方法检出限及定量限实验结果表
表2液体样品的方法检出限及定量限实验结果表
由表1可知，当固体或半流体称样量为10g，定容体积为100mL，取样体积为10mL时，该方法的检出限为0.346mg·kg-1，定量限为3.46mg·kg-1，均低于GB5009.34—2022规定的检出限1mg·kg-1，定量限6mg·kg-1，符合要求，本次实验的标准偏差0.0486mg·kg-1；
由表2可知，当液体取样量为10mL，定容体积为100mL，取样体积为10mL时，该方法的检出限为0.558mg·L-1，定量限为5.58mg·L-1，均低于GB5009.34—2022规定的检出限1mg·kg-1，定量限6mg·kg-1，符合要求，本次实验的标准偏差为0.0526mg·L-1。
2.3精密度
精密度的测量通常需要自由度至少为6，故选取一个样品进行7次重复性测定，得到的重复性实验的相对标准偏差为1.36%，结果见表3，符合GB/T27417—2017的要求。
2.4准确度
通过已知浓度的二氧化硫标液加入样品中，使加标后的样品二氧化硫的浓度分别处于标准曲线的低、中、高3个浓度，进行3水平6平行共计18个加标实验，按照标准的检测方法进行检测，经计算结果在90.4%～97.1%，均符合《合格评定化学分析方法确认和验证指南》（GB/T27417—2017）规定，当浓度水平为1～100mg·kg-1时，回收率为90%～110%，符合要求[6]。其结果见表4。
表3精密度实验结果表
表4样品加标回收结果表
按照《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）第二法分光光度法方法规定，通过对二氧化硫标准工作曲线的线性和线性范围、检出限、定量限、精密度及准确度进行方法验证，各项指标均符合要求，表明本实验室现有的设备、环境、人员等条件能满足《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）第二法分光光度法规定的方法，能展开此方法的检测。
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冼土秀，欧志秀，周丽贤，赵俊峰，许广元
（广东省绿色认证检测中心有限公司，广东广州510440）
二氧化硫被广泛用于食品加工中，是国内外食品加工业中允许使用的食品添加剂，具有漂白、护色、防腐和抗氧化的作用[1]。食品中的二氧化硫来源有外源性和内源性，外源性主要由采用硫磺熏制食品或使用能产生二氧化硫的盐类作食品添加剂时产生，内源性由某些食品在发酵过程中产生。按照国家标准合理使用二氧化硫不会对人体健康造成危害，但长期过量摄入二氧化硫可能导致人体呼吸系统疾病和多组织受损[2]。因此，我国规定了食品添加剂二氧化硫的使用限量和检测方法[3]。
《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2016）即将于2022年12月30日被废止，届时将被《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）所替代，主要变化在于修改了原滴定法为酸碱滴定法，增加了分光光度法和离子色谱法。检验方法的变更需要进行方法验证，本文对第二法分光光度法进行验证，验证了该方法的线性、线性范围、检出限、定量限、精密度及准确度6个参数。
1.1原理
样品直接用甲醛缓冲吸收液浸泡或加酸充氮蒸馏，使其中的二氧化硫释放被甲醛溶液吸收，生成稳定的羟甲基磺酸加成化合物，酸性条件下与盐酸副玫瑰苯胺生成蓝紫色络合物，该络合物的吸光值与二氧化硫的浓度成正比[4]。
1.2适用范围
《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）第二法分光光度法中，直接提取法适用于白糖及白糖制品、淀粉及淀粉制品、生湿面制品等无油脂且无颜色干扰试样中总二氧化硫的测定；
充氮蒸馏提取法适用于葡萄酒、赤砂糖等有颜色试样中总二氧化硫的测定。
1.3试剂与材料
1.3.1试剂与标准品
氨基磺酸铵（H6N2O3S）；
乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2Na2O8）；
甲醛（CH2O）；
邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4）；
0.2%盐酸副玫瑰苯胺（C20H20ClN3）溶液；
冰乙酸（C2H4O2）；
磷酸（H3PO4）；
二氧化硫标准溶液（100μg·mL-1），具有国家认证并授予标准物质证书。
1.3.2仪器和设备
UV-2600紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；
电子天平，感量为0.01g；
玻璃充氮蒸馏器。
1.3.3试剂配制
氢氧化钠溶液（1.5mol·L-1）：称取6.0gNaOH，溶于水并稀释至100mL。
乙二胺四乙酸二钠溶液（0.05mol·L-1）：称取1.86g乙二胺四乙酸二钠（简称EDTA-2Na），溶于水并稀释至100mL。
甲醛缓冲吸收储备液：称取2.04g邻苯二甲酸氢钾，溶于少量水中，加入36%～38%的甲醛溶液5.5mL，0.05mol·L-1EDTA-2Na溶液20.0mL，混匀，加水稀释并定容至100mL，贮于冰箱中冷藏保存。
甲醛缓冲吸收液：量取甲醛缓冲吸收储备液适量，用水稀释100倍，临用时现配。
盐酸副玫瑰苯胺溶液（0.5g·L-1）：量取0.2%盐酸副玫瑰苯胺溶液25.0mL，分别加入磷酸30mL和盐酸12mL，用水稀释至100mL，摇匀，放置24h，备用（避光密封保存）。
氨基磺酸铵溶液（3g·L-1）：称取0.30g氨基磺酸铵（H6N2O3S）溶于水并稀释至100mL。
盐酸溶液（6mol·L-1）：量取盐酸50mL，缓缓倾入50mL水中边加边搅拌。
1.4方法
参照（GB5009.34—2022）《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》第二法分光光度法进行测定。
2.1线性和线性范围
二氧化硫标准使用液浓度为10μg·mL-1。吸取0mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL和3.00mL的二氧化硫标准使用液用甲醛缓冲吸收液定容至10.00mL。经过计算，该系列标准溶液中二氧化硫的质量分别为0μg、2.0μg、5.0μg、10.0μg、20.0μg和30.0μg。标准曲线的制作按照标准进行，以质量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。标准工作曲线为y=0.0266x+0.0395，R2=0.9998。
根据《合格评定化学方法确认和验证指南》（GB/T27417—2017）规定准确定量的方法，线性回归方程的相关系数不低于0.99，本实验按照《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）规定的测试条件进行测试，其线性回归方程为y=0.0266x+0.0395，相关系数为0.9998，线性范围为0～30.0μg，符合标准规定的要求。
2.2检出限和定量限
检出限采用空白标准偏差法评估，即通过分析大量（n≥10）样品空白确定检出限（LOD）。本次实验通过10次样品空白独立测试，计算出检测结果的算数平均值（X）和标准偏差（S）确定检出限（LOD），计算公式为LOD=X+3S；
为增加数据的可信性，本实验以10倍检出限作为定量限[5]。具体结果见表1和表2。
表1固体或半流体样品的方法检出限及定量限实验结果表
表2液体样品的方法检出限及定量限实验结果表
由表1可知，当固体或半流体称样量为10g，定容体积为100mL，取样体积为10mL时，该方法的检出限为0.346mg·kg-1，定量限为3.46mg·kg-1，均低于GB5009.34—2022规定的检出限1mg·kg-1，定量限6mg·kg-1，符合要求，本次实验的标准偏差0.0486mg·kg-1；
由表2可知，当液体取样量为10mL，定容体积为100mL，取样体积为10mL时，该方法的检出限为0.558mg·L-1，定量限为5.58mg·L-1，均低于GB5009.34—2022规定的检出限1mg·kg-1，定量限6mg·kg-1，符合要求，本次实验的标准偏差为0.0526mg·L-1。
2.3精密度
精密度的测量通常需要自由度至少为6，故选取一个样品进行7次重复性测定，得到的重复性实验的相对标准偏差为1.36%，结果见表3，符合GB/T27417—2017的要求。
2.4准确度
通过已知浓度的二氧化硫标液加入样品中，使加标后的样品二氧化硫的浓度分别处于标准曲线的低、中、高3个浓度，进行3水平6平行共计18个加标实验，按照标准的检测方法进行检测，经计算结果在90.4%～97.1%，均符合《合格评定化学分析方法确认和验证指南》（GB/T27417—2017）规定，当浓度水平为1～100mg·kg-1时，回收率为90%～110%，符合要求[6]。其结果见表4。
表3精密度实验结果表
表4样品加标回收结果表
按照《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）第二法分光光度法方法规定，通过对二氧化硫标准工作曲线的线性和线性范围、检出限、定量限、精密度及准确度进行方法验证，各项指标均符合要求，表明本实验室现有的设备、环境、人员等条件能满足《食品安全国家标准食品中二氧化硫的测定》（GB5009.34—2022）第二法分光光度法规定的方法，能展开此方法的检测。
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